Real-time PCR

“เทคนิคที่ใช้ในการหาปริมาณกรดนิวคลีอิก (DNA / RNA) ที่มีอยู่ในตัวอย่าง หรือที่เรียกว่า PCR แบบเรียลไทม์ หรือเชิงปริมาณ (q) PCR”

Real-time PCR หรือที่รู้จักกันในชื่อ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) เป็นเทคนิคที่สามารถตรวจสอบ ผลิตภัณฑ์ PCR ที่สร้างขึ้นของยีนเป้าหมายเฉพาะแบบเรียลไทม์ได้โดยตรง ซึ่งมักถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจจับที่มีความละเอียดอ่อนเช่น SARS-CoV-2, ไวรัสไข้หวัดใหญ่, ไวรัส HPV ที่เป็นสาเหตุของมะเร็งปากมดลูก วิธีนี้เป็นวิธีที่มีความไวและความแม่นยำสูง และใช้เวลาเพียง 1-2 ชั่วโมงโดยประมาณในการทำงาน ทำให้ช่วยลดเวลาในการทำงานทั้งหมดของทางห้องปฏิบัติการได้ ส่งผลให้ทางห้องปฏิบัติการสามารถรายงานผลได้รวดเร็วยิ่งขึ้น

หลักการ

       Real-time PCR หรือที่รู้จักกันในชื่อ Quantitative PCR (QPCR) เป็นเทคนิคที่ถูกพัฒนามาจากการทำ PCR แบบดั้งเดิม (conventional PCR) โดยใช้การติดฉลากด้วยสารเรืองแสงประเภท fluorochrome ทำให้สามารถวัดปริมาณของดีเอ็นเอเป้าหมายตั้งต้นจากสิ่งต้องการตรวจวัดได้และสามารถวัดปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นมาได้ทันที โดยไม่จำเป็นต้องรอให้กระบวนการเสร็จสิ้นก่อน วิธีการ real-time PCR เป็นวิธีการหาปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นในปฎิกิริยา PCR ในแต่ละรอบทำให้ได้ค่าปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มจำนวนจริงจากค่าของ exponential phase ที่ได้จากการเริ่มต้นของดีเอ็นเอเป้าหมาย


การตรวจสอบทางเคมีของ real-time PCR

1. dsDNA-intercalating agents (DNA-binding dyes)

         การตรวจวัดปริมาณสายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นใหม่โดยใช้สารฟลูออเรสเซนซ์ที่สามารถจับกับดีเอ็นเอสายคู่ได้ (DNA binding fluorescent dyes) โดยทั่วไปที่นิยมใช้ คือ SYBR Green I เป็นสีฟลูออเรสเซนต์ที่สามารถเข้าจับกับดีเอ็นเอตรงตำแหน่งminor groove ของดีเอ็นเอสายคู่แบบไม่จำเพาะ เมื่อสารนี้ถูกกระตุ้นด้วยแสงอัตราไวโอเลตจะมีการคายพลังงานออกมา  ดังนั้นเมื่อเกิดปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอด้วย real-time PCR สัญญาณของสารเรืองแสง SYBR Green I ก็จะเพิ่มขึ้นตามปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้น แต่เมื่อรอบของ PCR กลับมาถึงช่วงการ denature อีกครั้ง SYBR Green I ก็จะหลุดออกจากสายดีเอ็นเอ ทำให้การเรืองแสงลดลงอีกครั้ง โมเลกุลของสีจะจับได้มากน้อยขึ้นกับความยาวของ PCR product

2. Hydrolysis probes (e.g., TaqMan probes)

         เป็น probe เส้นเดี่ยว ประกอบด้วย reporter dye ที่จับอยู่ปลาย 5’ ของ probe สี fluorescein นี้ได้แก่ FAM, TET และ HEX ส่วน Quencher dye จะจับที่ปลาย 3’ ของ probe เช่น TAMRA เมื่อเกิดการไฮบริไดเซซัน สี Fluorescein ของ reporter จะถูกกระตุ้น (excite) และปล่อยแสง (emit) ในการทำ real-time PCR เมื่อปฎิกิริยา extension เกิดขึ้น Taq DNA polymerase ที่มี 5’ nuclease activity จะตัด reporter dye ออกจาก probe ทำให้ reporter dye หลุดห่างออกจาก quencher dye และสามารถคายพลังงานออกมาในรูปของแสงฟลูออเรสเซนต์ เมื่อกระบวนการนี้ดำเนินต่อไปในแต่ละรอบจำนวนโมเลกุลของสัญญาณจะเพิ่มขึ้นทำให้การเรืองแสงเพิ่มขึ้นซึ่งสัมพันธ์กับการขยายของเป้าหมาย

ข้อดีของ Real-time PCR

  • เป็นวิธีที่คุ้มค่าเมื่อเทียบกับการทำ PCR แบบดั้งเดิม
  • เวลาในการวิเคราะห์ค่อนข้างเร็ว สามารถทราบผลได้ภายใน 30 นาที – 2 ชั่วโมง
  • เป็นวิธีที่มีความไว ความแม่นยำ และมีประสิทธิภาพสูง

Real-time PCR สามารถตรวจอะไรได้บ้าง

  • ตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อ หรือโรคทางพันธุกรรมต่างๆ Disease diagnosis
  • บ่งชี้การมีอยู่ของเชื้อก่อโรคหรือบ่งชี้สายพันธุ์เชื้อก่อโรคและวัดปริมาณเชื้อก่อโรค
    Genotyping and quantification of pathogens
  • ตรวจหาการกลายพันธืของเซลล์ต้องสงสัยมะเร็ง Cancer detection
  • SNP analysis
  • Identification and quantification of circulating nucleic acid หรือที่รูจักกันดีในชื่อ non-invasive diagnosis ต่างๆ ที่นิยมใช้ตรวจหาสารพันธุกรรมของลูกในตัวอย่างเลือดของแม่นั่นเอง